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知無不“研”|一文讀懂?染色質免疫共沉淀技術(ChIP)
文章來源:genecreate 作者:genecreate 發布時間:2020-06-08 17:01
        基于體內分析而發展的染色質免疫沉淀分析(Chromatin immunoprecipitation assay kit,ChIP)技術可以真實、完整地反映結合在DNA序列上的調控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活細胞或者組織的方法,因此能比較真實的反映細胞內TF與Promoter的結合情況,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。近年來,這種技術得到不斷的發展和完善。采用結合微陣列技術在染色體基因表達調控區域檢查染色體活性,是深入分析癌癥、心血管病以及中央神經系統紊亂等疾病主要通路的一種非常有效的工具。
       染色質免疫沉淀分析(ChIP)的基本原理是在活細胞狀態下,當用甲醛處理時,相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與核酸(DNA或RNA)之間會產生共價鍵。細胞內,當TF與Promoter相互結合時,它們必然靠的比較近或者契合在一起,這個時候用甲醛處理,能使它們之間產生共價鍵。固定的蛋白質-DNA復合物通過超聲或酶處理將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段,然后通過抗原抗體的特異性識別反應沉淀此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。通過qPCR或二代測序,篩選與目的蛋白互作的未知DNA信息。
       今天小編將珍藏多年的ChIP實驗心得拿出來與大家一同探討。
應用領域
1、判斷DNA鏈的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾
2、檢測RNA polymerase II及其它反式因子在基因組上結合位點的精確定位
3、研究組蛋白共價修飾與基因表達的關系
4、轉錄因子研究
技術流程
案例展示
案例一
題目:Hypoxia induces H19 expression through direct and indirect Hif-1α activity, promoting oncogenic effects in glioblastoma
期刊:scientific reports
主要內容:作者分別使用了兩種細胞U87和U251,驗證SP1對于H19的轉錄調控作用。用SP1抗體進行ChIP實驗,對H19的啟動子區域上游100bp的高GC含量,設計引物。富集到的DNA進行qPCR檢測,結果顯示SP1能夠調控H19啟動子的轉錄。
案例二
題目:Chromatin Profiling by Directly Sequencing Small Quantities of Immunoprecipitated DNA.  
期刊:Nat Methods
主要內容:收集培養的5×106K562細胞,使用組蛋白甲基化修飾抗體H3K27me3、H3K4me3、H3K36me3(ChIP-grade)進行IP富集提取的經過片段化的染色質復合物,構建測序文庫后進行二代測序,獲得peaks在染色質上的分布情況。
 
案例三
題目: A crucial role for the ubiquitously expressed transcription factor Sp1 at early stages of hematopoietic specification. 
期刊:Development
主要內容:分離培養小鼠胚胎干細胞并誘導分化,分別收集組細胞及Flk+細胞,用轉錄因子Sp1抗體進行ChIP實驗后二代測序,獲得Sp1結合位點在兩種細胞中的分布區域。
ChIP經驗分享
       ChIP實驗操作性很強,金開瑞根據多年的實踐,總結了一些ChIP實驗中您可能會遇到的棘手的問題,下面我們就一起來康康吧!
細胞固定
1、甲醛終濃度為1%較適宜
2、固定時間一般為5-60min較好,具體時間根據實驗而定
染色質斷裂
1、 超聲時斷時續,保證低溫
2、 注意探頭位置,防止產生泡沫
3、 研究組蛋白需使用酶處理
染色質免疫沉淀
1、 最好有Input對照。Input對照不僅可以驗證染色質斷裂的效果,還可以根據Input中的靶序列的含量以及染色質沉淀中的靶序列的含量,按照取樣比例換算出ChIP的效率,所以Input對照是ChIP實驗必不可少的步驟。
2、 抗體的選擇是關鍵??贵w的選擇要注意三點:一是應該選擇能夠做ChIP實驗的抗體。盡量選擇ChIP級別商業化的抗體。如沒有,一般可以重組到帶有標簽的載體上,再轉染相應的宿主(目前市面上商業化的chip抗體只有300多種,因此正好找到對應抗體較困難,可以選擇標簽抗體)。二是抗體的結合位點。選擇單抗的話,盡量遠離抗原和染色質相結合的位點,這樣可以最大限度保證抗體和抗原的結合,而多抗可識別多個表位,可基本避免該風險。因此單多抗各有優缺點,應重點關注該抗體是否經過ChIP驗證。三是抗體的濃度??贵w濃度的也很重要,濃度太低,不能與靶蛋白完全結合。濃度太高會導致非特異性條帶增加背景。
3、 陰性對照可以使用血清或lgG,陽性對照一般使用RNA Polymerase II或者組蛋白。
陰性對照:用實驗抗體同型的IgG作為抗體,理論上不會ChIP下來任何DNA片段,因此作為陰性對照,但是由于非特異結合,或者實驗過程中,沒發生結合的DNA清除不完全,可能也會出現條帶。如果陰性對照樣品中的產物量等于特異靶標樣品中產物量,說明特異靶標抗體未發揮作用或者染色質斷裂不充分。
陽性對照:為了保證陽性對照有效,一般選擇陽性對照的引物是根據管家基因設計的。一般用RNA Polymerase II或者Histone H3(組蛋白)抗體,因為RNA Polymerase II是通用轉錄因子,在所有細胞中都能結合基因的核心啟動子區。因此,理論上ChIP后PCR都會有條帶。
4、 需設計已經確定的、不與特異抗原相結合的DNA片段的引物,用來排除抗原和染色質的非特異結合。
交聯反應的逆轉
1、 RNA酶、蛋白酶需65℃保溫6小時
2、 不加蛋白酶可以提取、分析結合蛋白
DNA的純化
最好用試劑盒,便于后面的PCR檢測
DNA的鑒定
可以進行二代測序或者qPCR檢測結果
因為ChIP實驗涉及的步驟多,結果的重復性較低,所以對ChIP實驗過程的每一步都應設計相應的對照,而且對結果的分析也需要有一定的經驗。如果ChIP實驗方面有什么問題,歡迎與我們交流哦!
 
實驗Q&A
Q:ChIP-Seq和ChIP-qPCR有何異同?
A:染色質免疫共沉淀(ChIP)所獲得的DNA產物,在ChIP-Seq中通過高通量測序的方法,在全基因組范圍內尋找目的蛋白(轉錄因子、修飾組蛋白)的DNA結合位點片段信息;ChIP-qPCR需要預設待測的目的序列,針對目的序列設計引物,以驗證該序列是否同實驗蛋白結合互作。
Q:染色質片段大小在哪個范圍比較合適?
A:對于ChIP-seq,片段在200-500 bp左右是最合適范圍;對于ChIP-qPCR,片段在200-800 bp左右適宜。
Q:植物樣本處理和動物組織/細胞有何區別?
A:植物組織由于細胞壁、氣腔等結構的存在,會給交聯緩沖液的作用帶來困難,因此相對于動物組織/細胞來說,往往需要在抽真空條件下進行交聯,而該步奏是一個需要經驗及優化的過程。
Q:ChIP-Seq中的測序DNA樣本需要多少產量?
A:通常是≥10ng。
Q:ChIP風險如果判斷
A:ChIP實驗以標簽來判斷實驗風險,重組標簽的轉錄因子>內源轉錄因子>組蛋白;當以重組蛋白作為靶蛋白時,重組蛋白同內源蛋白可能存在結合活性、結合位點差異;以標簽抗體進行ChIP時、染色質結合位點本身會被內源蛋白競爭,這些都會影響到ChIP過程的特異性捕獲效率。

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